方法
- 测试系统:合并的人肝微粒体和重组个体表达人体酶及必要的辅因子
- CYP亚型:CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4。(亦可采用其他的CYP、UGT和药物代谢酶)。
- 采用同工型特异性化学抑制剂和重组酶进行确认。
供试品使用磷酸缓冲液中的微粒体进行至少5分钟的预培养。通过添加NADPH或其他适当的辅因子启动供试品代谢。通过添加有机溶剂终止培养,然后使用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)对供试品和/或其代谢物进行样品分析。
I期 - 优化体外培养条件
在采用NADPH或其他合适辅因子的情况下,供试品一式三份在一定的微粒体浓度范围(通常为0.1 - 1 mg蛋白/mL)内,按最长60分钟的四个时间点进行培养。
在没有辅因子的情况下进行培养控制。产生供试品消失线性率的微粒体浓度培养条件和时间点被用于定义后续实验。
II期 - 供试品代谢动力学分析
在经过优化的条件下,通过使用一式三份至少八种供试品浓度,对培养样品中的供试品消失速率进行监测。采用米切里斯-曼腾曲线拟合方法对数据进行分析,并确定供试品的动力学参数Km和Vmax。
III期 - 使用CYP特异性化学抑制剂进行抑制分析
在使用或不使用酶选择性化学抑制剂的情况下,供试品一式三份在合并的人肝微粒体中进行培养,浓度为<Km。在没有抑制剂,仅使用载体溶剂的情况下进行培养控制。
IV期 - 使用重组人体CYP的代谢
供试品一式三份按<Km的浓度采用一系列的重组人体CYP、UGT和其他DME(见上文)进行培养。在0分钟和60分钟时对供试品的相对浓度进行测定。
交付成果
这些检测方法将确定导致供试品体外代谢的酶及其代谢程度。供试品消失和/或代谢物形成的动力学得以确认。体外代谢评估可确定主要参与其中的酶,并在首次应用于人体试验之前提示体内清除机制的潜在问题。