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酶抑制

抑制细胞色素P450（CYP）和UGT酶是临床相关药物间相互作用的主要原因。通过确定供试品对基于混合人肝微粒体的培养中人CYP酶的选择性探针底物代谢的影响，评估供试品的抑制潜力。抑制酶动力学可得到进一步表征，得出的数据用于预测给药后是否可能发生具有临床意义的DDI。

  • FDA和EMA推荐的研究

  • 细胞毒性和稳定性测定

  • CYP mRNA和酶诱导

酶抑制研究的监管注意事项

FDA和EMA药物间相互作用（DDI）准则均建议开展这些研究，以便在进行首次应用于人体试验之前就可逆（直接）和不可逆（时间依赖性）细胞色素P450抑制生成数据。抑制数据用于确定临床DDI研究的要求和范围。

方法

  • 测试系统：混合人肝微粒体（HLM）
  • 得到评估的CYP酶：CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5
  • 可应要求在直接抑制分析中评估的UGT酶： UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT11A6、UGT1A9、UGT2B7、UGT2B15
  • 供试品浓度：8种浓度，一式三份
  • 所有样本的制备和培养均使用Hamilton Microlab Star自动化液体处理系统进行

 

CYP抑制作用可通过直接测定和依赖性测定衡量。使用一种CYP选择性底物，其浓度要达到每种CYP酶最大反应速度（Km）的一半（请参见下文）。已知的抑制剂被用作直接和代谢依赖性抑制检测的阳性对照。所有培养均通过添加冷却乙腈终止，冷却乙腈中含有对CYP底物具有特异性的稳定标记内部代谢物标准。

时间依赖性（不可逆）抑制

在不存在和存在NADPH的情况下，检测方法使用8种浓度的供试品培养30分钟，然后再稀释到探针底物分析混合物中。如果观察到明显的时间依赖性抑制，则可以确定其他动力学参数，包括失活常数（kinact）和抑制常数（KI）。这些参数通过改变预培养时间和抑制剂浓度以实验方式确定，可帮助确定药物间相互作用的潜力。

直接抑制

在存在和不存在8种浓度的供试品的情况下进行检测以确定抑制潜力，并在可能的情况下确定IC50。

通过使用5种浓度的探针底物来确定抑制常数（Ki）和观察到的抑制类型可以进一步表征直接抑制。

细胞色素P450底物分析物直接抑制时间依赖性抑制
CYP1A2非那西丁乙酰氨基酚氟伏沙明呋拉茶碱
CYP2B6安非他酮羟基安非他酮奥芬那君ThioTEPA
CYP2C8阿莫地喹去乙基重氮喹孟鲁司特吉非贝齐1-O-β-葡糖醛酸
CYP2C9双氯芬酸4'-羟基双氯芬酸磺胺苯并恶唑钛酸
CYP2C19甲苯妥英4'-羟基苯乙妥英努卡酮埃索美拉唑
CYP2D6右美沙芬葡聚糖奎尼丁帕罗西汀
CYP3A4/5睾酮6β-羟基睾丸激素酮康唑红霉素
CYP3A4/5咪达唑仑1'-羟基咪达唑仑酮康唑曲霉素

 

交付成果

这些检测方法将提供CYP酶直接或不可逆抑制的IC50值。如果观察到明显的直接抑制，则可以确定抑制常数（Ki）。如果观察到明显的时间依赖性抑制，则可以确定基于机理的失活参数（KI和kinact）。借助这些参数，定量药理学可以在评估临床试验需求时提供额外指导。