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药物间相互作用和转运体

膜药物转运蛋白位于人体内的多种屏障组织中，可与药物相互作用并影响药物在体内的吸收、分布和消除，是导致临床相关药物间相互作用（DDI）的原因。识别作为转运蛋白基质或抑制剂的供试品有助于诠释临床相关的风险变化以及伴随用药的毒性。药物的肠道通透性是促使药物吸收的重要因素，并可使用Caco-2单层转运检测方法进行评估。

转运蛋白相互作用的监管考虑因素

美国食品药品管理局（FDA）和EMA药物间相互作用（DDI ）指南均建议在首次应用于人体试验之前，通过这些研究来评估转运蛋白相互作用。转运蛋白研究可突出显示由于药物对吸收或分布的影响，在伴随用药时实现有效血浆浓度方面的潜在问题。

多种转运蛋白在临床应用中与药物相互作用。建议用于测试的转运蛋白包括：

  • ATP结合盒（ABC）外排性转运蛋白、P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和胆盐输出泵（BSEP）。
  • 溶质载体（SLC）摄取转运体、有机阴离子转运蛋白（OAT）1和OAT3、有机阳离子转运体（OCT）2、有机阴离子转运多肽（OATP）1B1、OATP1B3、多药及毒素挤压（MATE）1和MATE2 K。

转运体相互作用方法

  • 测试系统：表达单一摄取（SLC）转运蛋白或对照载体的转染细胞系，在湿化培养箱内37°C的温度下在5%的CO2中进行单层培养。
  • 检测缓冲液：HBSS及HEPES，pH 7.4
  • 仅限于MATE转运蛋白，细胞采用NH4Cl进行预处理，以便向细胞膜引入MATE摄取活性所必需的pH梯度
  • 供试品浓度：基质检测为2，抑制检测为2
  • 专用于每种转运蛋白的放射性标记探针底物
  • 适用于每种转运蛋白的阳性对照抑制剂

置于培养液中的转运蛋白表达细胞采用检测缓冲液在湿化培养箱内37°C的温度下在5%的CO2中进行30分钟的预培养。MATE表达细胞采用NH4CI进行处理，以在细胞膜上建立用于促进摄取活性的pH梯度。将探针底物或供试品添加至一式三份的对照孔内，并在适用情况下添加抑制剂。根据不同的转运蛋白，培养皿按一个2 - 10分钟的时间点进行培养。吸入缓冲液，冲洗细胞，然后进行裂解、采集并使用LC-MS分析供试品的存在性。

底物评估：经过2-5分钟的培养之后，将供试品被每种转运蛋白单独摄取或在使用选择性抑制剂的状态下被摄取的情况，与对照载体的摄取情况进行比较。作为对照，将分别进行探针底物被每种转运蛋白单独摄取，或在使用选择性抑制剂的情况下摄取，以及被对照载体摄取的测试。

抑制剂评估：将进行探针底物被每种转运蛋白单独摄取，或在使用选择性抑制剂或供试品的情况下被摄取的测试。此外，还将进行探针底物被对照载体摄取的测试作为对照。如果观察到抑制现象，则有可能确定IC50。

  • 测试系统：Caco-2人肠内皮细胞，放入置于湿化培养箱内的Transwell培养皿，在37°C的温度下在5%的CO2中培养21- 24天
  • 检测缓冲液：HBSS及HEPES，pH 7.4，在端室和基底外侧腔内
  • 在检测之前进行跨内皮电阻（TEER）测定以确认紧密连接的形成
  • 供试品浓度：基质检测为2，抑制检测为2
  • 使用放射性标记渗透性标记甘露醇和咖啡因来验证紧密连接的形成
  • 使用专门针对每种转运蛋白的放射性标记探针底物
  • 用于每种转运蛋白的阳性对照选择性抑制剂和阴性抑制剂对照

在Transwell培养皿上，对供试品和探针底物的表观渗透率从端室至基底外侧腔（A-B）和基底外侧腔至端室（B-A）进行双向测定。采用检测缓冲液在湿化培养箱内37°C的温度下在5%的CO2中进行30分钟的预培养后，将探针或供试品添加至一个腔室（供体）中，并将空白缓冲液加入与之相对的腔室（接收体）中。然后在适用情况下，将抑制剂添加至两个腔室中。培养皿在37°C的温度下在5%的CO2中培养2小时。使用LC-MS收集供体和接收体样本并分析供试品的存在性。然后确定供试品的渗透率和射流比。

底物评估：对仅限于供试品或在使用选择性抑制剂情况下的转运蛋白进行双向测定。针对探针底物在单独存在每种转运蛋白或使用选择性抑制剂状态下的转运情况，作为对照进行测试。

抑制剂评估：在单独培养或使用选择性抑制剂或供试品培养2小时之后，对探针底物的转运情况进行双向测定。如果观察到外排性转运抑制现象，则有可能确定IC50。

  • 测试系统：膜泡（50 µg/孔）表达外排性（ABC）转运蛋白BSEP。
  • 供试品浓度：底物检测为2，抑制检测为2。
  • 以单磷酸腺苷（AMP）作为对照，测定三磷酸腺苷（ATP）依赖性活性。
  • 专用于BSEP的放射性标记探针底物
  • 适用于每种转运蛋白的阳性对照抑制剂

膜泡表达BSEP和供试品或探针底物将在96孔培养皿内进行培养。通过添加三磷酸腺苷（ATP）启动摄取，然后在37°C的温度下培养30分钟。同时使用单磷酸腺苷（AMP）作为阴性对照。通过真空抽吸终止摄取，并用大量的冰冷转运缓冲液清洗过滤器两次。然后在滤板上提取膜泡，用于LC‑MS定量和ATP依赖性活性计算。

底物评估：将仅限于供试品和使用选择性抑制剂及ATP状态下的摄取情况与使用AMP的摄取情况进行对比。针对探针底物被BSEP单独摄取和使用选择性抑制剂状态下的摄取情况，作为对照进行测试。

抑制剂评估：将进行探针底物被单独摄取，或在使用选择性抑制剂或供试品的情况下被摄取的测试；将使用ATP的摄取情况与使用AMP的摄取情况进行对比。如果观察到依赖于ATP的供试品摄取抑制现象，则有可能确定IC50。

 

交付成果

这些检测方法将能确定和描述底物或抑制剂与膜药物转运蛋白的相互作用。数据将描述摄取和/或外排的程度、供试品渗透性、转运蛋白抑制性以及适用的IC50值。

这些数据还可以用来基于与伴随疗法可能的相互作用评估DDI风险，并有助于对候选新药进行排名。如果观察到相互作用，药理学可以在评估临床试验需求时提供额外指导。